مهدیه قیاثی و همکاران مجله دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی تهران خرداد 1394 دوره 73 شماره 3 صفحههاي 158 تا 167 روي داربستهاي مختلف زیستی

Transcript

1 مهدیه قیاثی و همکاران 158 مجله دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی تهران خرداد 1394 دوره 73 شماره 3 صفحههاي 158 تا 167 مقاله اصیل مهدیه بیان ژنهاي کلاژن یک- دو اگریکان و SOX9 سلولهاي بنیادي مزانشیمی تمایزیافته 1 1 قیاثی رضا طباطباي ی قمی *1 2 محسن نیکبخت محسن شیخحسن 1- گروه سلول بنیادي آزمایشگاه سلولهاي بنیادي جهاد دانشگاهی قم قم ایران. 2- گروه بیوتکنولوژي پزشکی مرکز تحقیقات هماتولوژي- انکولوژي و پیوند سلولهاي بنیادي دانشگاه علوم پزشکی تهران بیمارستان شریعتی تهران ایران. * نویسنده مسي ول: قم خیابان بنیاد میدان ایثار خیابان شبنم مرکز فوق تخصصی درمان ناباروري جهاد دانشگاهی قم آزمایشگاه سلولهاي بنیادي تلفن: mohsen_sheikhhasan@yahoo.com چکیده روي داربستهاي مختلف زیستی زمینه و هدف: انتخاب داربست مناسب یکی از عوامل بسیار مهم در یک تکنیک موفق مهندسی بافت است که امکان مهاجرت سلولها انتقال عوامل زیست فعال و همچنین فراهمسازي محیط رشد مطلوب براي سلولهاي بنیادي را ایجاد مینماید. در این پژوهش به ارزیابی قابلیت دو داربست مختلف بهعنوان محیطی مناسب جهت تکثیر و تمایز سلولهاي بنیادي مزانشیمی برگرفته از چربی پرداخته شد. روش بررسی: این مطالعه بهصورت تجربی در آزمایشگاه سلولهاي بنیادي جهاد دانشگاهی استان قم از اردیبهشت تا اسفند 1392 انجام شده است. دو داربست فیبرینگلو و آلژینات بهعنوان دو گروه مجزا تهیه گردید و سلولهاي بنیادي مزانشیمی پس از جداسازي از بافت چربی و تکثیر کافی بهصورت جداگانه بر روي این دو داربست قرار گرفته و در محیط کندروژنیک کشت داده شدند. پس از گذشت 14 روز ارزیابی توانایی بقاي سلولی و بیان ژنهاي کلاژن I و II SOX9 و اگریکان (Aggrecan) در سلولهاي مزانشیمی مشتق از چربی کشت شده بر روي هر داربست بهصورت مجزا بهترتیب توسط روشهاي (4 3 و 5 -دي متیل) تیازول- 2 -یل- و 2 5 -دي متیل تترازولیوم بروماید و Real-time PCR صورت پذیرفت. همچنین تشکیل بافت غضروفی بر روي داربستها توسط آنالیز هیستولوژي مورد بررسی قرار گرفت. یافتهها: داربست فیبرینگلو تفاوت معناداري را از لحاظ قابلیت بقا نسبت به داربست آلژینات در محیط تمایزي به غضروف نشان داد (0/0=P). همچنین نتایج حاصل از آنالیز Real-Time PCR نشان داد که داربست فیبرینگلو در مقایسه با داربست آلژینات ژنهاي ویژه غضروفی را در سطح بالاتري بیان مینماید. نتیجهگیري: استفاده از داربست طبیعی فیبرینگلو میتواند بهعنوان محیط مناسبی بهمنظور تکثیر و تمایز سلولهاي بنیادي مزانشیمی برگرفته از چربی در مهندسی بافت غضروفی در نظر گرفته شود. کلمات کلیدي: سلولهاي بنیادي مزانشیمی بافت چربی فیبرینگلو آلژینات. دریافت: 1393/09/09 پذیرش: 1393/12/12 آنلاین: 1394/02/20 مقدمه در طول دهههاي گذشته ظرفیت محدود توانایی خود ترمیمی غضروف مانعی در برابر بازسازي و درمان آسیبهاي موجود در این بافت محسوب شده است. در سالهاي اخیر فنآوري مهندسی بافت با استفاده از سلولها و سیستم انتقالی مناسب بهمنظور ترمیم نقایص غضروفی در حال توسعه میباشد. با اینکه پیوند کندروسیت اتولوگ بهعنوان یک روش درمانی مورد تایید میباشد با این حال بهدلیل ظرفیت تکثیري پایین این سلولها در محیط آزمایشگاهی و عوارضی که در هنگام نمونهبرداري در مکان دهنده کندروسیت ایجاد میشود 1 کمتر از این روش استفاده میگردد. با این حال هم اکنون کاربرد بالینی سلولهاي بنیادي مزانشیمی حاصل از مغز استخوان بهدلیل آسیب رساندن به محل اهدا و ماهیت تهاجمی بسیار بالاي این روش و ایجاد درد زیادي که براي اهداکننده بههمراه دارد خود بهعنوان 1 چالشی براي سلول درمانی محسوب میگردد. مجله دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی تهران خرداد 1394 دوره 73 شماره تا 167

2 و 1 و بیان ژنهاي کلاژن یک- دو اگریکان و sox9 سلولهاي بنیادي مزانشیمی تمایزیافته در داربستهاي زیستی سلولهاي بنیادي مزانشیمی برگرفته از چربی انسانی بهعنوان جانشین سلولهاي بنیادي مزانشیمی حاصل از مغز استخوان با 2 مقبولیت زیادي در زمینه مهندسی بافت غضروف مواجه شده است. این سلولها میتوانند توسط روش لیپوساکشن ساده از بافت چربی زیرجلدي با کمترین عوارض و درد ممکن براي فرد اهداکننده حاصل شوند. گزارشات حاکی از آن است که سلولهاي بنیادي مزانشیمی در خصوصیاتی همچون قابلیت تمایز به چندین رده کنیتیک رشد و پیري با سلولهاي بنیادي مزانشیمی حاصل از مغز استخوان قابل 3 قیاس هستند. همچنین سلولهاي بنیادي مزانشیمی حاصل از بافت چربی از لحاظ مورفولوژي حتی و بیان نشانگرهاي سلولهاي حاصل از مغز استخوان شباهت دارند. سطحی نیز به 2 همان این نکته بهخوبی شناخته شده است که بهمنظور هدایت فرایند تمایز سلولهاي بنیادي مزانشیمی حاصل از چربی به رده غضروفی شرایط کشت سه بعدي مورد نیاز میباشد. بدینمنظور این سلولها بر روي داربستها در محیط آزمایشگاهی کشت داده میشوند. داربستها ساختارهاي مبتنی بر مواد زیستی هستند که به دو گروه داربستهاي طبیعی و مصنوعی 3 طبقهبندي میشوند. آن در ابتدا این مواد تنها براي انتقال دارو و هورمون به بدن کاربرد داشتند ولی پژوهشهاي بعدي نشان داد که این مواد توانایی ایجاد یک بستر مناسب بهمنظور حفظ نگهداري و تمایز سلولها به ردههاي مختلف سلولی را نیز دارند. مهندسی بافت غضروف نیازمند طراحی یک داربست با ساختار فیزیکی مناسب و امکان چسبندگی سلولها به مهاجرت تکثیر و تمایز سلولی و در نهایت رشد و بازسازي بافت جدید متخلخل در است. بهعنوان ماتریکس بافت مهندسی خارج سلولی ابتدا میبایستی داربست یا یک براي ماده رشد سلولها تهیه گردد. بنابراین داربستهاي هیدروژلی منشا گرفته از مواد زیستی که قابلیت ایجاد شرایط رشد و تمایز مطلوب براي سلولها دارا میباشند میتوانند در ترمیم 4 غضروف مورد استفاده قرار گیرند. بافت نرمی همچون از میان این مواد زیستی پلیمرهاي طبیعی همچون آلژینات و فیبرینگلو جهت استفاده در زمینه مطالعاتی و بالینی غضروفی تصدیق شدهاند. آلژینات پلی ساکارید خطی است که داراي بلوكهاي تکراري از مانورونات و گلورونات میباشد. آلژینات بهدلیل دارا بودن ضخامت مناسب و همچنین بهعنوان یک سیستم انتقال سلولهاي بنیادي جهت درمان نقایص غضروفی شناخته شده و در زمینههاي پژوهشی مرتبط با مهندسی بافت غضروفی بهطور گسترده مورد استفاده قرار گرفته است. 6 فیبرین ترکیب فیزیولوژیکی خون است که بیش از 20 سال در زمینههاي بالینی 6 کاربرد دارد. در سالهاي اخیر فیبرین بهدلیل ویژگیهاي منحصر به فرد خود همچون سازگارپذیري و تجزیهپذیري زیستی و اتولوگ بودن کاربردهاي مختلفی را در زمینه مهندسی بافت و طب ترمیمی پیدا کرده است. همچنین سازمان غذا و داروي آمریکا 7-10 (FDA) فیبرینگلو را تایید نموده است. بهتازگی زیستشناسی مولکولی از روشهاي کم ی جهت بررسی توانایی تمایزي سلولهاي بنیادي مزانشیمی مشتق از چربی و بهدست آوردن نتایج قابل اعتماد و قابل مقایسه بهره گرفته است. از جمله این روشها که براي ارزیابی بیان ژنهاي ویژه غضروف مورد استفاده قرار میگیرد روش Real-Time PCR است که از مزایایی همچون حساسیت بالا طیف وسیع پویایی دامنه دینامیک گسترده 11 دقت زیاد و قابلیت اتوماسیون برخوردار میباشد. در این مطالعه به ارزیابی توانایی تکثیر بقا و تمایز سلولهاي بنیادي مشتق از چربی به رده غضروفی بر روي دو داربست طبیعی فیبرینگلو و آلژینات بهصورت مجزا پرداخته شد. روش بررسی این مطالعه بهصورت تجربی از نوع آزمایشگاهی vitro) (in بوده و از اردیبهشت تا اسفند 1392 در آزمایشگاه سلولهاي بنیادي جهاد دانشگاهی استان قم انجام شده است. محیط DMEM جهت کشت سلول از در این پژوهش آلژینات و (Sigma Aldrich, Steinheim, Germany) استفاده شد. سرم جنین گوساله و آنتیبیوتیک پنیسیلین- استرپتومایسین USA) (Gibco, Life Technologies, خریداري شد. در این مطالعه آزمایشگاهی نمونه بافت چربی از لیپوساکشن بیماران با رضایت آنها دریافت گردید و در سرم فیزیولوژي حاوي آنتیبیوتیک از بیمارستان به آزمایشگاه انتقال یافت. نمونه چندینبار با Phosphate-buffered saline (PBS) در آزمایشگاه و سرم فیزیولوژي شسته شده و به قطعات کوچکتر تقسیم شد. سپس این Tehran Univ Med J (TUMJ) 2015 June;73(3):

3 و 5 و 2 مهدیه قیاثی و همکاران قطعات بهوسیله آنزیم کلاژناز I mg g هضم شده و سلولهاي بنیادي مزانشیمی از آنها جداسازي گردید. به این صورت که ابتدا به ازاي هر 1 چربی دقیقه در دماي دقیقه با سرعت 1/5 آنزیم کلاژناز I به آن اضافه و بهمدت 45 تا 60 C 37 انکوبه شد. سپس تحت سانتریفوژ بهمدت دور در دقیقه قرار گرفته و پس از پایان سانتریفوژ محلول رویی آن حذف و رسوب سلولی حاصله در محیط کشت DMEM حاوي آنتیبیوتیک پنیسیلین/ استرپتومایسین و Fetal %5 و رطوبت %99 CO 2 %10 و دماي 37 C Bovine Serum (FBS) قرار داده شد. پس از گذشت یک روز سلولهایی که به کف فلاسک نچسبیده بودند با تعویض محیط از فلاسک حذف شدند. سلولها هر هفته یکبار پاساژ شدند تا به پاساژ سه رسیدند (شکل 1). محیط کشت سلولها هر سه روز یکبار تعویض گردید. سلولها سپس در مرحله پاساژ سه جهت استفاده آماده گردید. جهت تهیه محیط کندروژنیک از انسولین- آلبومین گاوي ترانسفرین- سلنیوم DMEM-High Glucose بههمراه %1 دگزامتازون 100 %1 آسکوربات -2 فسفات µg/l µg/l 5 فاکتور رشد ng/ml TGF-β3 نانومولار سرم 50 لینولي یک اسید 10 و پنیسیلین- استرپتومایسین %1 6 استفاده شد. پلاسماي تازه منجمد و فیبرینوژن از سازمان انتقال خون قم تهیه شد. پلاسماي تازه منجمد به نسبت پنج به سه به کلسیم گلوکونات اضافه شده و بهمدت یک ساعت در دماي 37 انکوبه و سپس C بهمدت 10 دقیقه با 2200 دور در دقیقه سانتریفوژ شد. در مرحله بعد پس از سانتریفوژ محلول رویی آن حذف و ترومبین آن جداسازي گردید. فیبرینوژن و ترومبین حاصله براي استفاده جهت کشت سلول آماده شد. بههمین منظور ابتدا سلولهاي بنیادي برگرفته از چربی با غلظت سلول در هر سیسی در داخل ترومبین بهصورت محلول درآمده و فیبرینوژن به آنها اضافه گردید و در نهایت با اضافه کردن محیط کندروژنیک بهمدت 14 روز در دماي انکوباتور C %5 و رطوبت %99) CO 2 37 C) ابتدا پودر آلژینات 0/15 در (%1/2) 15 قرار گرفت. 37 در داخل مول/لیتر کلرید سدیم به حالت محلول درآمده و محلول حاصله با استفاده از فیلتر استریل شد. سپس سلولهاي بنیادي مزانشیمی مشتق از چربی پاساژ سه پس از تریپسینه شدن بهمدت هشت دقیقه در 1400 دور در دقیقه سانتریفوژ شده و دوباره در محلول آلژینات به حالت محلول درآمد. در ادامه نمونهها به محلول کلرید کلسیم 105 میلیمولار اضافه شده و بهمدت دقیقه در دماي اتاق قرار داده شد. دانههاي آلژینات پس از شستشو با کلرید سدیم و DMEM و اضافه کردن محیط کندروژنیک در محیط بهمدت گرفتند. 14 روز در دماي 37 C و CO 2 %5 12 قرار ارزیابی توانایی زنده ماندن سلول پس از گذشت 14 روز از کشت سلولها بر روي داربستها و در حضور محیط تمایز به غضروف انجام ml پذیرفت. 5 -دي متیل) تیازول- 2 لی- 0/5 محیط کشت DMEM و 50 محلول 4)3) MTT و l - 5 -دي متیل تترازولیوم بروماید mg/ml 0/5 5) به داربستها اضافه شد. پس از چهار ساعت انکوباسیون ml nm دي متیل سولفوکسید به محلول حاصل اضافه شد. پس از گذشت 20 دقیقه در نهایت میزان جذب نوري سلول/ داربست در طول موج 570 توسط Stat Fax 3200 Microplate Reader (Awareness 12 و 14 USA) Technology, Inc., Palm City, FL, اندازهگیري شد. ابتدا تمامی نمونههاي RNA پس از گذشت 14 روز از تمایز به غضروف از هر کدام از داربستها بهطور مجزا استخراج شد. داربستها در داخل نیتروژن مایع تخریب شده و سپس RNA با استفاده از (Bioneer Co., Daedeok-gu, Daejeon, Korea) کیت و بر اساس دستورکار مربوطه استخراج گردید. خلوص و مقدار RNAي استخراجشده توسط اندازهگیري جذب نوري در طول موجهاي استفاده از 0 با 0/280 و nm Spectrophotometer, NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific Inc., Wilmington, USA) معکوس RNA به cdna با استفاده از کیت تعیین گردید. نسخهبرداري AccPower RT Premix Korea) (Bioneer Co., و PCR با استفاده از کیت بر اساس دستورکار مربوطه و Real-time SYBR Green PCR Master Mix (Applied USA) Biosystems, Austin, TX, و دستگاه Rotor Gene 6000 Real- Australia) Time PCR Machine (Corbett Life Science, در شرایط استاندارد PCR انجام پذیرفت. ) در این روش بهمنظور نرمالسازي دادهها از ژن خانهداري مرجع "بتا-اکتین" که در سلولها داراي بیان ثابت و بدون تغییر میباشد استفاده گردید. پرایمرهاي اختصاصی ژن مرجع و ژنهاي ویژه غضروف مورد استفاده در این مطالعه توسط software, version 3 (Applied Biosystems, Primer Express Austin, TX, USA طراحی گردید (جدول 1). سطح بیان هر کدام از ژنهاي هدف با استفاده از منحنی استاندارد محاسبه گردید. مجله دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی تهران خرداد 1394 دوره 73 شماره تا 167

4 161 بیان ژنهاي کلاژن یک- دو اگریکان و sox9 سلولهاي بنیادي مزانشیمی تمایزیافته در داربستهاي زیستی جدول 1: توالی پرایمرها ژنهاي مورد استفاده در آنالیز Real-Time PCR نام پرایمر توالی ( 3 5) CTCCTGGAGCATCTGGAGAC پرایمر مستقیم (HF ) COL1A1 طول قطعه 128 دماي ذوب 58/74 60/25 57/ GTCTCACCACGATCACCCTT GAATCAACTGCTGGAGACCA پرایمر معکوس (HF ) COL1A1 پرایمرمستقیم آگریکان (ACAN) (NM_ ) پرایمر معکوس آگریکان (ACAN) (NM_ ) 59/38 61/16 58/30 59/25 59/ CCACTGGTAGTCTTGGGCAT AGTACCCGCACTTGCACAAC CGTTCTTCACCGACTTCCTC CTCCTGGAGCATCTGGAGAC GTCTCACCACGATCACCCTT پرایمر مستقیم (SOX9) (NG_ ) Sex Determining Region Y (SRY)-box 9 پرایمر معکوس (SOX9) (NG_ ) Sex Determining Region Y (SRY)-box 9 پرایمر مستقیم (X ) COL2A1 پرایمر معکوس (X ) COL2A1 پرایمر مستقیم بتا-اکتین (AK ) پرایمر معکوس بتا-اکتین (AK ) * شماره شناسایی (ID) ژنها در پایگاه نوکلي وتیدي NCBI سلولهاي کشتشده بر روي داربستها در فرمالدیید بافر شده با فسفات با درصد حجمی/ حجمی 61/16 58/ GAGACCTTCAACACCCCAGCC AGACGCAGGATGGCATGGG %10 سپس نمونه تثبیت شدند. رقتها در درجههاي رقت %50 %70 %95 و %100 اتانول آبگیري شده و در داخل پارافین غوطهور شدند و سپس به قطعات با ضخامت 4 بریده شدند. سرانجام قطعات جهت ارزیابی مورفولوژي با m رنگهاي هماتوکسیلین/ اي وزین رنگآمیزي شدند. با استفاده از آنالیز واریانس ANOVA و تست LSD کوچکترین تفاوت معناداربودن در سطح بیان چهار ژن بین دو داربست مشخص گردید. آنالیز آماري با استفاده از software, SPSS version 17 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA) سطح معناداري با ارزش 0/05>P مشخص گردید. یافتهها انجام پذیرفت و در کشت اولیه سلولهاي بنیادي مزانشیمی مشتق از چربی با ظاهري شبیه به فیبروبلاست یا دوکیشکل با هستههاي مشخص رشد کردند که توسط میکروسکوپ فاز متضاد مشاهده گردید (شکل 1). با افزایش پاساژ جمعیت همگنتري از سلولهاي دوکیشکل با هستههاي مشخص که مورفولوژي تیپیک سلولهاي بنیادي مزانشیمی میباشد مشاهده گردید بهطوري که در پاساژ سوم سلولهاي یکنواختی با رشد و افزایش در تعداد آنها بهدست آمد (شکل 1). براي شروع فرایند تمایز غضروفی تعداد سلول/ میلیلیتر در پاساژ سوم بر روي هر کدام از داربستها قرار گرفت و در محیط تمایزي کشت شد. از لحاظ تست MTT با توجه به آزمون LSD بین داربست فیبرینگلو و گردید (نمودار 1). کنترل (P<0/05) اختلاف معناداري مشاهده تمایز سلولهاي بنیادي مزانشیمی به غضروف توسط PCR تایید شد. بدینصورت که بیان ژنهاي اگریکان کلاژن Real-Time II و I SOX9 در سلولهاي تمایزیافته پس از 14 روز بررسی گردید (نمودار 2). بر اساس آنالیز Real-Time PCR و با توجه به آزمون LSD میزان بیان ژنی اگریکان کلاژن II و I SOX9 در فیبرینگلو با آلژینات و سلولهاي بنیادي مزانشیمی مشتق از چربی ) هب عنوان کنترل) اختلاف معناداري را نشان داد که در جدول 2 مشخص است. پس از رنگآمیزي هماتوکسیلین/ اي وزین داربستهاي حاوي سلولهاي بنیادي مزانشیمی برگرفته از چربی که در محیط تمایز به غضروف بهمدت چهار کندروسیتها بر روي داربستها تایید شد هفته قرار داشتند وجود و تشکیل نتیجه 2). (شکل رنگآمیزي پس از 28 روز مشخص کرد که ماتریکس خارج سلولی شامل مواد زمینهاي غضروف به رنگ صورتی و سلولهاي کندروسیتی به رنگ بنفش میباشد. Tehran Univ Med J (TUMJ) 2015 June;73(3):

5 مهدیه قیاثی و همکاران 162 د ج ب الف شکل 1: مراحل مختلف تکثیر و کشت سلولهاي بنیادي مزانشیمی برگرفته از چربی انسان (الف- د) ج ب الف شکل 2: ارزیابی هیستولوژي بافت غضروفی: الف: کنترل ب: سلولهاي تمایزیافته بر روي داربست فیبرینگلو ج: آلژینات نمودار 1: ارزیابی MTT سلولهاي بنیادي مزانشیمی مشتق از چربی تمایزیافته به غضروف بر روي داربستهاي فیبرینگلو و آلژینات * اختلاف معنادار با گروه کنترل (0/05>P) نمودار 2: بیان SOX9 mrna اگریکان کلاژن I و II در سلولهاي تمایزیافته بر روي داربستهاي فیبرینگلو و آلژینات * اختلاف معنادار با گروه کنترل (0/05>P) مجله دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی تهران خرداد 1394 دوره 73 شماره تا 167

6 163 بیان ژنهاي کلاژن یک- دو اگریکان و sox9 سلولهاي بنیادي مزانشیمی تمایزیافته در داربستهاي زیستی جدول 2: مقایسه میزان بیان ژنهاي مخصوص غضروف فاکتور بیان کلاژن I بین گروه کنترل و فیبرینگلو بیان کلاژن I بین گروه آلژینات و فیبرینگلو بیان کلاژن II بین گروه کنترل و فیبرینگلو بیان کلاژن II بین گروه آلژینات و فیبرینگلو بیان کلاژن آکریکان بین گروه کنترل و فیبرینگلو بیان کلاژن آکریکان بین گروه آلژینات و فیبرینگلو بیان کلاژن SOX9 بین گروه کنترل و فیبرینگلو بیان کلاژن SOX9 بین گروه آلژینات و فیبرینگلو P 0/028 0/003 0/001 0/003 0/033 0/024 0/037 0/029 در مطالعه حاضر میزان بیان ژنهاي اختصاصی غضروف شامل I و کلاژن نوع II اگریکان و SOX9 در سلولهاي بنیادي مزانشیمی تمایزیافته به غضروف بر روي دو داربست طبیعی آلژینات و فیبرینگلو بهصورت جداگانه توسط روش Real-Time PCR مورد بررسی قرار گرفت تا تغییرات بیان آنها بر روي هر یک از داربستها مشخص گردد. همچنین ارزیابی میزان تکثیر و قابلیت بقاي سلولهاي تمایزیافته بر روي این دو داربست بهصورت جداگانه توسط تست MTT انجام پذیرفت تا قابلیت این داربستها در ایجاد محیطی مناسب جهت رشد و بقاي این سلولها مشخص گردد. با تعیین بیان ژنی در دو داربست فیبرینگلو و آلژینات میتوان تغییرات مورفولوژي سلولهاي تمایزیافته را در دو داربست با بیان ژنهاي اختصاصی غضروفی ارتباط داد. در معمول بهطور استراتژيهاي سلول درمانی به تعداد زیادي سلول جهت ایجاد پیوند نیاز میباشد اما با توجه به خصوصیات نامطلوب سلولهاي غضروفی از لحاظ تعداد اندك سلول و قابلیت رگزایی بسیار ضعیف آنها امکان استفاده از این سلولها در زمینه سلول درمانی با محدودیت 12 مواجه شده است. سلولهاي بنیادي مزانشیمی مشتق از چربی یکی از جایگزینهاي مناسب براي سلولهاي کندروسیتی بهشمار میرود که در زمینه تحقیقات مهندسی بافت غضروفی مورد استقبال گستردهاي قرار گرفته و با تکثیر و تمایز این سلولها به بافت غضروفی میتوان از آنها بهمنظور اهداف سلول درمانی ضایعات این بافت استفاده 12 نمود. گروههاي متعددي نشان دادند که سلولهاي بنیادي مشتق از چربی قابلیت تمایز به رده غضروفی را در شرایط آزمایشگاهی دارند 21 که مطالعه ما نیز گواهی بر این ادعاست. نتایج حاصل از مطالعات نشان داد که فرایند تمایز سلولهاي بنیادي به غضروف در چهار مرحله متوالی صورت میپذیرد که در هر مرحله چندین ژن مخصوص غضروف بیان میشوند مهمترین ژنهاي بیانشده در مرحله اول کلاژن نوع که از جمله I و SOX4 VI و 20 XI کلاژن HAPLN1 COMP میباشند. همچنین ژنهاي BMP2 و SOX9 در مرحله دوم این فرایند بیان میگردند. مهمترین ژنهاي بیان شده در مرحله سوم عبارتند از کندروادهرین و میباشند کادهرین N- و در آخرین مرحله ژنهایی همچون اگریکان آلکالین فسفاتاز کلاژن نوع میشوند. و IX II X فیبرومودولین و فیبرونکتین بیان در این فرایند ابتدا سلولهاي بنیادي مزانشیمی توسط فاکتورهاي پاراکرینی که بیان فاکتورهاي رونویسی اصلی را افزایش میدهند متعهد به غضروفسازي میشوند که این فرایند باعث فعال شدن ژنهاي مخصوص غضروف در آنها میگردد. در مرحله دوم سلولهاي بنیادي مزانشیمی متعهد شده در قالب گرههاي متراکمی فشرده شده و به کندروسیتها تمایز مییابند. در طی مرحله سوم کندروسیتها به سرعت تکثیر شده و محتواي سیتوپلاسمی خود را افزایش میدهند و مقدار زیادي از ماتریکس خارج سلولی ویژه غضروف را ترشح مینمایند. پس از این مرحله بیان پروفایل سلولها تغییر کرده و کلاژن نوع X و فیبرونکتین ترشح میگردند. تمایز پیشسازهاي غضروفی توسط تجزیه ماتریکس غضروفی حاوي کلاژن XI و X و IX SOX9 20 و 22 و و اگریکان تعیین خصوصیت میگردد. یکی از مارکرهایی است که در سلولهاي قرار گرفته در مرحله تراکم بیان میگردد. این فاکتور رونویسی یکی از قدرتمندترین کاندید تنظیم غضروف بهشمار میرود که بهعنوان یک تنظیمکننده کلیدي فرایند تمایز به کندروسیتها و تشکیل غضروف محسوب میگردد که میتواند بلوغ هیپرتروفی را در مراحل خاصی از تمایز غضروفی به تاخیر بیاندازد. این فاکتور جهت بیان ژن کلاژن نوع II بحث و دیگر پروتیینهاي ماتریکس ویژه غضروفی مورد نیاز میباشد. دو عضو Tehran Univ Med J (TUMJ) 2015 June;73(3):

7 مهدیه قیاثی و همکاران 164 دیگر خانواده SOX یعنی L-SOX5 و SOX6 نه تنها در اوایل مرحله تراکم مزانشیمی بیان میگردند بلکه بهصورت همزمان با SOX9 در 22 و طول تمایز غضروفی نیز بیان میشوند. ورکاسین و اگریکان دو عضو خانواده پروتي وگلیکانهاي تجمعیافته بزرگ هستند که داراي الگوهاي ساختاري مشترك بوده و با فعالیت مشترکی بهصورت قدرتمند به هیالورونان اتصال مییابد. اگریکان بهصورت فراوان در طول گسترش و نمو غضروف بیان شده و در مقدار بالا در سراسر دوره کودکی در انواع مختلف غضروف حفظ میشود. مرحله اول تمایز به غضروف در برهمکنش ایجاد شده 22 شش روز اول آن انجام میپذیرد. زمانی که بین سلولها و محیط باعث ایجاد تحریک میگردد سلولهاي مزانشیمی مجاور شروع به بیان فاکتور رونویسی SOX9 مینمایند که باعث غضروفسازي دخیل هستند. کنترل ژنهایی میشود که در در نتیجه فعال شدن این ژنها باعث تولید ماتریکس خارج سلولی غضروفی میشوند. سلولهاي مزانشیمی تحت تاثیر تنظیم با فاکتورهاي رونویسی SOX9 مییابند. بهتدریج به کندروبلاستها تمایز سپس کندروبلاستها بالغ شده و در فرایندهاي مورفوژنتیکی شرکت میکنند که شروع به تشکیل یک قالب بههم پیوسته در کنارههاي هر مفصل مینماید. تراکم سلولهاي بنیادي مزانشیمی بهواسطه ژن SOX9 صورت میپذیرد که اولین مرحله در 24 غضروفسازي میباشد. بر اساس دادههاي گفتهشده پژوهشهاي زیادي در زمینه میزان تغییرات بیان ژنهاي مختلف طی تمایز به غضروف سلولهاي بنیادي مزانشیمی در محیط سه بعدي صورت پذیرفته است. نتایج حاصل از مطالعه Hamid و همکاران نشان داد که سلولهاي بنیادي مشتق از چربی انسان بهطور معنادار مقدار زیادي از کلاژن نوع II اگریکان COMP الاستین و کلاژن نوع XI را یک 25 هفته پس از تحریک در محیط تمایز به غضروف بیان مینمایند. همچنین نتایج حاصل از این مطالعه نشان داد که کشت متوالی در محیط القاي غضروفسازي افزایش بیان SOX9 را در سلولهاي بنیادي مشتق از چربی در مقایسه با کنترل در پی دارد و بیان آن را به بالاترین سطح خود در هفته سوم پس از کشت میرساند که میتواند باعث تحریک شروع تولید ماتریکس غضروفی شود که مطالعه ما نیز 25 این نتایج را تایید نمود. مطالعاتی نیز نشان دادند که بیان بسیاري از ژنهاي غضروفی (کلاژن نوع II COMP اگریکان الاستین و کلاژن (XI نوع در سلولهاي بنیادي مشتق از چربی انسانی در محیط تک لایه در هفته دوم و سوم پس از کشت 25 کاهش مییابد. بنابراین کشت متوالی سلولها در محیط القاي غضروفسازي بهروش تک لایه نمیتواند باعث تحریک 25 جهت افزایش اندازه تجمعات سلولی گردد. این نتایج پیشنهاد میکند بیشتر تولید ماتریکس خارج سلولی که محیط کشت سه بعدي در القاي تمایز به غضروف در سلولهاي بنیادي و بیان ژنهاي مخصوص غضروف ژن 25 میتواند موثر باشد. نتایج حاصل از مطالعه Mehlhorn و همکاران تایید نمود که در مدت سه روز اول ژنها بیان نمیشود بلکه Col2a1 (کلاژن نوع میدهد. در طول مدت در پایان (II جمله COMP اگریکان و کلاژن نوع 14 روز بیش تنظیمی نشان 14 روز ژنها یا پروتیینهاي غضروفی از II-Α در سلولها بیان شدند. همچنین افزایش معناداري در میزان بیان COMP و اگریکان در این مطالعه مشاهده گردید. اما بیش تنظیمی ژن Col2a1 (کلاژن نوع (II در روز چهاردهم تنها در صورت وجود TGF-β صورت پذیرفت. مطالعه Garza-Veloz و همکاران نیز نشان داد که تغییرات معناداري در بیان ژنهاي خاص غضروفی از جمله COMP و ACAN SOX9 در طول فرایند غضروفسازي از سلولهاي بنیادي مزانشیمی رخ 27 میدهد. بر اساس نتایج حاصل از مطالعات مشخص گردیده است که غضروفسازي توسط در معرض قرارگرفتن سلولها با فاکتورهاي القاکننده غضروفی همچون فاکتورهاي رشد در بازه زمانی خاص تنظیم میگردد. بسیاري از مطالعات تاثیر فاکتورهاي گروه TGF-β را در غضروفسازي سلولهاي بنیادي مزانشیمی تایید نمودند. با تکیه بر نتایج حاصل از این مطالعات بهنظر میرسد که یکی از عوامل مهم تاثیرگذار در بیان شدن ژنهاي ویژه غضروفی و تمایز سلولهاي بنیادي مزانشیمی مشتق از چربی در این مطالعه فاکتور رشدي 28 و 29 TGF-β3 باشد. همچنین مطالعات نشان داد TGF-β3 که بهصورت معناداري میتواند تکثیر سلولهاي بنیادي مزانشیمی را افزایش دهد. این فاکتور میتواند ترکیبی از اثرات مهاري و القایی را بر روي تمایز 33 غضروفسازي داشته باشد. مطالعه Mehlhorn و همکاران نشان دادند که سلولهاي بنیادي مزانشیمی مشتق از چربی در محیط حاوي TGF-β3 توانایی تمایز به غضروف را نشان میدهد که مطالعات ما مجله دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی تهران خرداد 1394 دوره 73 شماره تا 167

8 165 بیان ژنهاي کلاژن یک- دو اگریکان و et al. sox9 سلولهاي.M بنیادي Ghiasi مزانشیمی تمایزیافته در داربستهاي زیستی نیز این موضوع را به اثبات رسانید. بر اساس مطالعات دیگر تمایز به غضروف سلولهاي بنیادي مزانشیمی میتواند توسط اعضاي سوپرخانواده فاکتور رشد انتقالی بتا 34 (TGF-β) تحریک گردد. چرخه تمایزي و فعالیت بیوسنتزي سلولهاي بنیادي مزانشیمی توسط محیط 34 بیوفیزیکی آنها تنظیم میگردد. محیط کشت حاوي فاکتورهاي رشد خانواده TGF-β در طول تکثیر میتواند باعث بیان افزایش یافته ژن کلاژن در 34 II گردد. مطالعهاي Rada و همکاران نشان دادند که سلولهاي بنیادي مزانشیمی مشتق از مغز استخوان بهوسیله تحریک فاکتورهاي رشد خانواده TGF-β و با بیش تنظیمی با Col2a1 SOX9 35 و اگریکان بهسمت غضروفسازي تمایز داده میشوند. حاصل از این پژوهش نشان داد نتایج که سلولهاي بنیادي مزانشیمی مشتق از چربی قابلیت تکثیر و بقا و تمایز به سلولهاي کندروسیت مانند را در محیط آزمایشگاهی و در صورت وجود فاکتورهاي ویژه (فاکتور رشد TGF-β3 و دگزامتازون) داشته و این قابلیت در محیط مناسبی همچون فیبرینگلو و آلژینات بهعنوان داربست باعث افزایش تکثیر و بقا و بیان ژنهاي ویژه غضروفی از جمله کلاژن و اگریکان میگردد. کلاژن نوع در II I و با وجود اینکه ژنهاي مخصوص غضروف II اگریکان و SOX9 در سلولهاي تمایزیافته بر روي هر دو داربست بهصورت جداگانه بیان گردید اما میزان بیان این ژنها بر روي داربست فیبرینگلو بهصورت معناداري نسبت به میزان بیان این ژنها بر روي داربست آلژیناتی و کنترل افزایش نشان داد. پژوهش حاضر ماهیت غضروفی سلولهاي تمایزیافته بر روي داربستها بهصورت جداگانه با روشهاي مولکولی و هیستولوژیک بررسی شد و به دلایل زیر ماهیت غضروفی سلولهاي تمایزیافته تایید گردید: Rada نشان دادند و همکاران که تمامی زیرجمعیتهاي سلولهاي بنیادي ژنهاي SOX9 و کلاژن جدا شده از بافت چربی انسان 35 II را بیان مینمایند. در این مطالعه با توجه به اینکه پس از گذشت سه هفته از کشت سلولهاي جداسازيشده 35 SOX9 توسط این سلولها بیان شد نویسندگان این پژوهش پیشنهاد کردند که سلولها بهاحتمال زیاد در مرحله بین پیش کندروسیتی و سلولهاي غضروفی ستونی قرار دارند. بررسیهاي تحقیق حاضر نشان داد که سلولهاي تمایزیافته بر روي داربستها تمام ژنهاي اختصاصی غضروف شامل اگریکان و II و کلاژن SOX9 را بیان میکنند که با توجه به پژوهشهاي پیشین نشان میدهد که سلولهاي بنیادي مزانشیمی بر روي داربستها به غضروف تمایز یافتهاند. همچنین با استفاده از آنالیز هیستولوژیک تشکیل بافت کندروسیتی تایید گردید. با توجه به بیان شدن ژنهاي II کلاژن SOX9 و اگریکان و با در نظر گرفتن روند فرایند غضروفی و نتایج هیستولوژي میتوان گفت که تمایز سلولهاي مزانشیمی مشتق از چربی در این پژوهش در مراحل پایانی غضروفسازي قرار دارد. نتایج نشان داد که انتخاب داربستهاي سلولی در رشد و تمایز سلولهاي بنیادي بالغ تاثیرگذارند. هیدروژلهاي طبیعی همچون فیبرین ویژگیهاي متمایزي دارند که به آنها این امکان را میدهد که بستر مناسبی را براي رشد و تمایز سلولهاي بنیادي مزانشیمی ایجاد نمایند و بهعنوان یک عامل کلیدي در مهندسی بافت غضروفی مورد استفاده قرار گیرند. سپاسگزاري: این مقاله حاصل (بخشی از) طرح تحقیقاتی مصوب جهاد دانشگاهی قم با عنوان "بررسی پایداري کندروسیتهاي حاصل از تمایز سلولهاي بنیادي مزانشیمال مشتق از بافت چربی در چهار داربست طبیعی و سنتتیک" است که در طی سالهاي 1391 تا 1393 در آزمایشگاه سلولهاي بنیادي جهاد دانشگاهی قم اجرا شده است. References 1. Ahmed TA, Hincke MT. Strategies for articular cartilage lesion repair and functional restoration. Tissue Eng Part B Rev 2010;16(3): Jo CH, Lee YG, Shin WH, Kim H, Chai JW, Jeong EC, et al. Intraarticular injection of mesenchymal stem cells for the treatment of osteoarthritis of the knee: a proof-of-concept clinical trial. Stem Cells 2014;32(5): Guilak F, Lott KE, Awad HA, Cao Q, Hicok KC, Fermor B, et al. Clonal analysis of the differentiation potential of human adiposederived adult stem cells. J Cell Physiol 2006;206(1): Park JS, Yang HN, Woo DG, Jeon SY, Park KH. Chondrogenesis of human mesenchymal stem cells in fibrin constructs evaluated in vitro and in nude mouse and rabbit defects models. Biomaterials 2011;32(6): Tehran Univ Med J (TUMJ) 2015 June;73(3):

9 Expression of collagen type I and II, aggrecan and SOX9 genes in mesenchymal stem cells Ning C. Fabrication of alginate hydrogel scaffolds and cell viability in calcium-crosslinked alginate hydrogel. [MS thesis]. Canada: Saskatoon, SK: University of Saskatchewan; Awad HA, Wickham MQ, Leddy HA, Gimble JM, Guilak F. Chondrogenic differentiation of adipose-derived adult stem cells in agarose, alginate, and gelatin scaffolds. Biomaterials 2004;25(16): Ahmed TA, Dare EV, Hincke M. Fibrin: a versatile scaffold for tissue engineering applications. Tissue Eng Part B Rev 2008;14(2): Ahmed TA, Griffith M, Hincke M. Characterization and inhibition of fibrin hydrogel-degrading enzymes during development of tissue engineering scaffolds. Tissue Eng 2007;13(7): Ahmed TA, Halpenny M, Atkins H, Giulivi A, Dervin G, Griffith M, et al. Stabilization of fibrin mesenchymal stem cells (MSCs) constructs under hypoxic conditions during tissue engineering of articular cartilage. J Bone Joint Surg Br 2010;92-B: Park JS, Shim MS, Shim SH, Yang HN, Jeon SY, Woo DG, et al. Chondrogenic potential of stem cells derived from amniotic fluid, adipose tissue, or bone marrow encapsulated in fibrin gels containing TGF-β3. Biomaterials 2011;32(32): Bernstein P, Sticht C, Jacobi A, Liebers C, Manthey S, Stiehler M. Expression pattern differences between osteoarthritic chondrocytes and mesenchymal stem cells during chondrogenic differentiation. Osteoarthritis Cartilage 2010;18(12): Ghiasi M, Tabatabaei Qomi R, Kalhor N, Fazaeli H, Mehdizadeh M, Sheykh Hasan M. The design of scaffolds for use in tissue engineering. SMU Med J 2014;1(2):1-73. [Persian] 13. Sheykhhasan M, Tabatabaei Qomi R, Kalhor N, Ghiasi M. Isolation and maintenance of canine adipose-derived mesenchymal stem cells in order to tissue engineering application. Int J Adv Biol Sci Engin (IJABSE) 2014;1(2): Sheykh Hasan M, Kalhor N, Tabatabaei Qomi R, Ghiasi M. Optimization method for isolation and culture of chondrocytes in human nasal cartilage tissue. Int J Adv Biol Sci Engin (IJABSE) 2014;1(1): Ahmed TA, Giulivi A, Griffith M, Hincke M. Fibrin glues in combination with mesenchymal stem cells to develop a tissue-engineered cartilage substitute. Tissue Eng Part A 2011;17(3-4): Yang HN, Park JS, Woo DG, Jeon SY, Do HJ, Lim HY, et al. Chondrogenesis of mesenchymal stem cells and dedifferentiated chondrocytes by transfection with SOX Trio genes. Biomaterials 2011;32(30): Mobasheri A, Kalamegam G, Musumeci G, Batt ME. Chondrocyte and mesenchymal stem cell-based therapies for cartilage repair in osteoarthritis and related orthopaedic conditions. Maturitas 2014;78(3): Tigli RS, Cannizaro C, Gumusderelioglu M, Kaplan DL. Chondrogenesis in perfusion bioreactors using porous silk scaffolds and hesc-derived MSCs. J Biomed Mater Res A 2011;96(1): Proulx MK, Carey SP, Ditroia LM, Jones CM, Fakharzadeh M, Guyette JP, et al. Fibrin microthreads support mesenchymal stem cell growth while maintaining differentiation potential. J Biomed Mater Res A 2011;96(2): Crowley C, Birchall M, Seifalian AM. Trachea transplantation: from laboratory to patient. J Tissue Eng Regen Med 2015;9(4): Fraser JK, Wulur I, Alfonso Z, Hedrick MH. Fat tissu e: an underappreciated source of stem cells for biotechnology. Trends Biotechnol 2006;24(4): Diekman BO, Rowland CR, Lennon DP, Caplan AI, Guilak F. Chondrogenesis of adult stem cells from adipose tissue and bone marrow: induction by growth factors and cartilage-derived matrix. Tissue Eng Part A 2010;16(2): Venkatesan JK, Ekici M, Madry H, Schmitt G, Kohn D, Cucchiarini M. SOX9 gene transfer via safe, stable, replication-defective recombinant adeno-associated virus vectors as a novel, powerful tool to enhance the chondrogenic potential of human mesenchymal stem cells. Stem Cell Res Ther 2012;3(3): Shen Y, Fu Y, Wang J, Li G, Zhang X, Xu Y, et al. Biomaterial and mesenchymal stem cell for articular cartilage reconstruction. Curr Stem Cell Res Ther 2014;9(3): Hamid AA, Idrus RBH, Saim AB, Sathappan S, Chua K-H. Characterization of human adipose-derived stem cells and expression of chondrogenic genes during induction of cartilage differentiation. Clinics 2012;67(2): Mehlhorn AT, Niemeyer P, Kaiser S, Finkenzeller G, Stark GB, Sudkamp NP, et al. Differential expression pattern of extracellular matrix molecules during chondrogenesis of mesenchymal stem cells from bone marrow and adipose tissue. Tissue Eng 2006;12(10): Garza-Veloz I, Romero-Diaz VJ, Martinez-Fierro ML, Marino- Martinez IA, Gonzalez-Rodriguez M, Martinez-Rodriguez HG, et al. Analyses of chondrogenic induction of adipose mesenchymal stem cells by combined co-stimulation mediated by adenoviral gene transfer. Arthritis Res Ther 2013;15(4):R Clarke LE, McConnell JC, Sherratt MJ, Derby B, Richardson SM, Hoyland JA. Growth differentiation factor 6 and transforming growth factor-beta differentially mediate mesenchymal stem cell differentiation, composition, and micromechanical properties of nucleus pulposus constructs. Arthritis Res Ther 2014;16(2):R Banks JM, Mozdzen LC, Harley BA, Bailey RC. The combined effects of matrix stiffness and growth factor immobilization on the bioactivity and differentiation capabilities of adipose-derived stem cells. Biomaterials 2014;35(32): Barsby T, Bavin EP, Guest DJ. Three-dimensional culture and transforming growth factor beta3 synergistically promote tenogenic differentiation of equine embryo-derived stem cells. Tissue Eng Part A 2014;20(19-20): Toh WS, Foldager CB, Pei M, Hui JH. Advances in mesenchymal stem cell-based strategies for cartilage repair and regeneration. Stem Cell Rev 2014;10(5): Ahmed N, Dreier R, Gopferich A, Grifka J, Grassel S. Soluble signalling factors derived from differentiated cartilage tissue affect chondrogenic differentiation of rat adult marrow stromal cells. Cell Physiol Biochem 2007;20(5): James AW, Xu Y, Lee JK, Wang R, Longaker MT. Differential Effects of transforming growth factor-beta1 and -beta3 on chondrogenesis in posterofrontal cranial suture-derived mesenchymal cells in vitro. Plast Reconstr Surg 2009;1(1): Thorpe SD, Buckley CT, Kelly DJ. Can dynamic compression in the absence of growth factors induce chondrogenic differentiation of bone marrow derived MSCs encapsulated in agarose hydrogels? 8 th International Conference on Cell and Stem Cell Engineering (ICCE): IFMBE Proceedings, 2011;30: Rada T, Reis RL, Gomes ME. Distinct stem cells subpopulations isolated from human adipose tissue exhibit different chondrogenic and osteogenic differentiation potential. Stem Cell Rev 2011;7(1): مجله دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی تهران خرداد 1394 دوره 73 شماره تا 167

10 167 Tehran University Medical Journal, June 2015; Vol. 73, No. 3: Original Article Expression of collagen type I and II, aggrecan and SOX9 genes in mesenchymal stem cells on different bioscaffolds Mahdieh Ghiasi M.Sc. 1 Reza Tabatabaei Qomi M.Sc. 1 Mohsen Nikbakht Ph.D. 2 Mohsen Sheykhhasan M.Sc. 1* 1- Department of Stem Cell, Laboratory of Stem Cell, The Academic Center for Education, Culture and Research, Qom, Iran. 2- Department of Hematology- Oncology and Stem Cell Transplantation Research Center, Tehran University of Medical sciences, Shariati Hospital, Tahran, Iran. * Corresponding author: Shabnam St., Isar Sq., Imam Khomeini Town (Bonyad), Qom, Iran. Tel: mohsen_sheikhhasan@yahoo.com Abstract Received: 30 Nov Accepted: 03 Mar Available online: 10 May 2015 Background: Stem cells represent an ideal cell source for application in tissue engineering and regenerative medicine due to their ability to proliferate and differentiate to a wide variety of cell lineages. With recent development of medical sciences and tissue engineering, usage of adipose-derived mesenchymal stem cells, their culture and differentiation on suitable scaffolds are considered as a successful clinical and research strategy. One of the most crucial factors in a successful tissue engineering technique is to choose an appropriate scaffold which allow cell migration transferring of bioactive factors as well as providing optimal growth environment for stem cells. In this study, the ability of two scaffolds is investigated as a suitable environment for the proliferation and differentiation of adipose-derived mesenchymal stem cells. Methods: This is an in vitro study that was performed in Laboratory of Stem Cell in Academic Center for Education, Culture and Research, Qom province from April 2013 to February In this study, two scaffolds including fibrin glue and alginate were prepared as two separate groups and after isolating mesenchymal stem cells from adipose tissue and adequate proliferation, they were seeded into each scaffold in chondrogenic medium. After 14 days, the evaluation of viability and gene expression of collagen II and I, SOX9 and aggrecan were done by MTT (3-{4,5-dimethylthiazol-2yl}-2,5- diphenyl-2h tetrazolium bromide) assay and real-time PCR technique respectively. Also, cartilaginous tissue formation on scaffolds was evaluated by histological analysis. Results: According to the obtained results, the fibrin glue scaffold showed significant difference in terms of viability in comparison to alginate scaffold in chondrocyte differentiating medium (P< 0.05). Also the results of real-time PCR analysis showed that the fibrin glue scaffold express cartilage specific genes at a higher level than alginate scaffold. Conclusion: The use of natural fibrin glue scaffold can be considered as a suitable environment for proliferation and differentiation of adipose-derived mesenchymal stem cells in cartilage tissue engineering. Keywords: adipose tissue, alginate, fibrin tissue adhesive, mesenchymal stem cells. Tehran Univ Med J (TUMJ) 2015 June;73(3):